将能够统一催化机制不同的反应于单一活性位点的酶设计出来，代表了合成生物催化领域的一个前沿方向，有望实现与天然存在的多步酶促系统相媲美的效率和选择性。

一个典型的例子是胺类直接转化为酯类，该过程在自然界中是分别进行的：黄素依赖性胺氧化酶催化氧化脱氨生成酮，而Baeyer-Villiger单加氧酶（BVMOs）随后将酮氧化为内酯或酯。胺氧化酶的催化反应通常会产生化学计量的副产物过氧化氢（H₂O₂），这在制备和全细胞环境中可能有害，需要依赖过氧化物清除酶或添加剂来防止氧化损伤和副反应。

尽管使用过酸或过渡金属催化剂的经典化学策略可以实现酮到酯的转化，但它们无法催化氧化脱氨反应，这突显了功能上的持续空白以及选择性、底物范围和可持续性方面的局限性。虽然BVMOs能在温和条件下操作，具有出色的立体选择性和区域选择性，但它们对胺类底物无活性，这进一步强调了这一挑战。

尽管经历了广泛的进化分化，黄素依赖性酶仍保留着辅因子，并介导广泛的氧化还原转化，包括烯烃还原、(去)卤化、羟基化、氧化脱氨和Baeyer-Villiger氧化（BVO）。最近的工程化努力凸显了其机制的灵活性：Old Yellow酶已被改造用于Morita-Baylis-Hillman C─C偶联反应，黄素介导的氧化去对称化可在手性烯酮中构建季碳立体中心，而进化出的BVMO变体（例如AcHYAM）能够实现光催化氢胺化反应，产率高达97%，对映体比例为95:5。

尽管如此，在单一活性位点内精确耦合连续的氧化还原步骤，同时管理像H₂O₂这样的反应性副产物，在很大程度上仍未得到探索，这凸显了将胺氧化（AO）和BVO统一到一种催化剂中的可行性和变革潜力。

图1.本研究中使用的化学和生物催化策略（摘自Science Advances）

黄素依赖性胺氧化酶采用多种催化机制。在几种已解析结构的胺氧化酶中，氧化脱氨通过组氨酸辅助的质子抽取并结合底物Cα─H向黄素N5的氢化物转移进行，形成亚胺，后者自发水解为相应的酮。其他胺氧化酶家族，包括单胺氧化酶，缺乏催化性组氨酸残基，并使用替代的机制途径。

然后，该酮通过C4a-(羟基/过氧)黄素中间体参与BVO循环，从而实现受区域和立体控制的氧原子插入。胺氧化酶和BVMOs在机制上的部分兼容性表明，只要质子中继网络、活性位点静电学和过氧黄素寿命被精确调控，将两者整合到单一活性位点是可行的。

在AO阶段，H₂O₂作为化学计量的副产物生成。尽管在某些条件下，黄素系统中存在过氧化物依赖的氧插入途径，但本研究聚焦于BVO步骤典型的NADPH[还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP⁺）]/O₂（氧气）依赖性过氧黄素机制。受耦合生物催化领域进展的启发——包括共轭还原-还原胺化、双功能甲基转移酶-环化酶、氧化还原酶/Diels-Alderase以及邻位氧螯合样蛋白——以及由祖先序列重建（ASR）实现的核酸酶和发光脱卤酶功能拓展，作者采用了一种功能导向的ASR策略来探究黄素酶中的多功能协同作用。

通过整合来自AO和BVMO谱系的进化信号，作者重建了一个内在倾向于这两种化学反应的祖先黄素蛋白支架，同时结构预测和计算建模为耦合的AO-BVO循环建立了机制框架。

在此，一种双功能祖先黄素氧化酶AncFO-221被设计出来，用于在单一活性位点内催化氧化脱氨和BVO反应。通过ASR整合了胺氧化酶和BVMOs的进化信号，计算建模为耦合的AO-BVO循环建立了机制框架。

机制研究和靶向诱变证实了催化循环以及关键残基的作用。这些工作产生了高性能变体M15，其对多种胺和硫醚底物的活性提高了约18倍，并展现出可编程的区域选择性。

通过将AO步骤生成的氧化剂导向随后的氧插入步骤，本研究进一步提出了一种方法，以简化氧化生物转化过程，同时减少对过氧化物管理的需求，这一点在全细胞和面向工艺的应用中尤为重要。

这项工作为整合自然界中分离的酶促模块建立了一个机制引导的范式，为可编程的多步催化平台提供了蓝图。

参考消息：https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.aef2491